在 1506 年的巴利亚多利德(Valladolid)和1510 年马德里的两次卡斯蒂利议会上，查理宣誓成为阿斯图里亚斯亲王（Prince of Asturias），成为母亲乔安娜女王的法定继承人。
另一方面，在1502年，阿拉贡议会在萨拉戈萨（Zaragoza）召开，并对乔安娜作为推定继承人宣誓，但萨拉戈萨大主教阿隆索·德·阿拉贡（斐迪南国王的私生子）坚决表示，这个誓言没有法理根据，也就是说，除非议会和国王之间达成正式协议，否则不能改变继承权。
在斐迪南二世于1516年1月23日去世后，乔安娜继承了阿拉贡王冠，领土包括阿拉贡、马略卡、加泰罗尼亚、瓦伦西亚、那不勒斯、西西里和撒丁岛，而查理则成为总督。
尽管如此，佛兰明人还是希望查理继承王室头衔，这得到了皇帝马克西米利安一世和教皇利奥十世的支持。
因此，在1516年3月14日费尔南德二世的葬礼之后，查理与他的母亲共同被宣布为卡斯蒂利亚和阿拉贡的国王。
最后，当卡斯蒂利亚摄政王红衣主教希门尼斯·德·西斯内罗斯 （Jiménez de Cisneros）接受了既成事实时，他同意查理的要求并在全国推广其即位。
查理于1517年秋天抵达他的新的王国。
红衣主教希门尼斯·德·西斯内罗斯前来迎接他，但在途中生病，怀疑是中毒，在未能到达国王之前就去世了。
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由于查理在其合法女王母亲仍在世时就继承王室头衔的特殊情况，与巴利亚多利德的卡斯蒂利亚议会的谈判非常困难。
最终，查理被接受，但有很多条件：
他必须学习说卡斯蒂利亚语；
不得任命外国人；
禁止从卡斯蒂利亚提走超出五分之一（Quinto Real）的贵金属；
尊重他的母亲——乔安娜女王的权利。
1518年2月，卡斯蒂利亚议会在巴利亚多利德向他致敬。
之后，查理前往阿拉贡王室。
他成功克服了阿拉贡议会和加泰罗尼亚议会的抵抗，被认定为阿拉贡国王和巴塞罗那伯爵，与母亲共同统治。
但他的母亲被囚禁，只能名义上统治。
纳瓦尔王国于1512年被阿拉贡的费尔南德与卡斯蒂利亚共同侵占，但他发誓要尊重这个王国。
查理登基时，纳瓦尔议会要求他参加加冕仪式（成为纳瓦尔的查理四世），但这一要求未得到回应，议会不断积累不满。
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尽管西班牙人对帝国风格感到不安，但还是接受了查理为君主。
西班牙的各个王国传统都不相同。
卡斯蒂利亚已经成为一个专制的、高度集权的王国，君主自己的意志很容易凌驾于立法和司法机构之上。
相比之下，在阿拉贡王室，尤其是在比利牛斯山脉的纳瓦拉王国，法律盛行，君主制被视为与人民的契约。
这给查理五世和后来的国王带来了诸多不便和争议，因为特定王国的传统限制了他们的绝对权力。
在查理统治期间，政府变得更加绝对，尽管在他的母亲于1555年去世之前，查理并没有掌握国家的绝对权力。
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很快，对皇帝的抵抗就出现了，为了支持卡斯蒂利亚人对外国战争而征收的重税，而卡斯蒂利亚人对这些战争兴趣不大。
查理倾向于选择弗拉芒人担任卡斯蒂利亚和美洲的高级职位，而忽视了卡斯蒂利亚的候选人。
抵抗运动以之前提到的公民起义（Revolt of the Comuneros） 达到l了高潮，查理镇压了这场起义。
这次起义释放了乔安娜，并希望废黜查理，支持乔安娜成为唯一的君主。
虽然乔安娜拒绝废黜她的儿子，但她的监禁在起义后继续进行，以防止可能发生的类似事件。
在镇压卡斯蒂利亚叛乱后，查理又面临纳瓦尔（Navarre）的问题，亨利二世国王（King Henry II）试图重新征服该王国。
主要军事行动持续到1524年，当时洪达里比亚（Hondarribia）向查理的军队投降，但在1528年前，西比利牛斯山西部的频繁跨境冲突仍在继续。
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在这些事件之后，纳瓦尔在接下来一个世纪仍然是国内外争议的焦点（法国对王位的继承权主张直至1830年七月革命才结束）。
查理希望他的儿子和继承人菲利普二世与纳瓦尔的继承人让娜·德·阿尔布雷特 （Jeanne d'Albret）结婚。
让娜反而被迫嫁给了朱利希-克莱夫斯-贝格公爵威廉，但那段没有孩子的婚姻在四年后被取消。
她又嫁给了安托万·德·波旁 （Antoine de Bourbon），她和他们的儿子纳瓦拉的亨利 （Henry of Navarre） 都在法国宗教战争中反对菲利普二世。
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