1539年，土耳其舰队攻击并摧毁了利马索尔（Limassol）。
由于担心日益扩张的奥斯曼帝国，威尼斯加强了法马古斯塔（Famagusta）、尼科西亚（Nicosia）和基尔尼亚（Kyrenia）的防御，但大多数其他城市却易于被攻陷。
到1563年，威尼斯的人口已降至约16.8万人。
1570年夏季，土耳其人再次发起进攻，但这次是全面入侵，而非突袭。
约6万名军队，包括骑兵和炮兵，在穆斯塔法·帕夏（Mustafa Pasha）的指挥下，于1570年7月2日无阻地登陆在利马索尔附近，并对尼科西亚发起围攻。
在城市陷落的那一天，即1570年9月9日，2万名尼科西亚居民被处死，所有教堂、公共建筑和宫殿都遭到洗劫。
屠杀的消息迅速传播，几天后，穆斯塔法毫无抵抗地攻占了基尔尼亚。
然而，法马古斯塔进行了抵抗，防御持续到1570年9月直至1571年8月。
法马古斯塔的沦陷标志着塞浦路斯进入奥斯曼时期。
两个月后，由威尼斯、西班牙和教皇舰船组成的圣联盟海军，在奥地利的唐·胡安（Don John of Austria）指挥下，在勒班托战役（battle of Lepanto）中击败了土耳其舰队。
尽管在海上战胜了土耳其人，塞浦路斯仍在接下来的三个世纪中处于奥斯曼统治之下。
到1575年，威尼斯的人口约为17.5万人。
但部分由于1575到1576年的瘟疫，到1581年，人口降至12.4万人。
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根据经济历史学家扬·德·弗里斯（Jan De Vries）的说法，到17世纪初，威尼斯在地中海的经济实力已经显着下降。
德·弗里斯将这种衰退归因于香料贸易的丧失、竞争力下降的纺织工业、复兴的天主教会在图书出版方面的竞争、三十年战争对威尼斯主要贸易伙伴的不利影响，以及棉花和丝绸进口成本的增加。
1606年，威尼斯与教皇国之间发生了冲突，因两名被指控轻微犯罪的神职人员被捕，以及一项限制教会享有和获取土地财产的法律。
教皇保罗五世（Pope Paul V）认为这些条款违反教会法，并要求废除。
当这一要求被拒绝后，他对威尼斯施加了禁令，禁止神职人员执行几乎所有的祭司职责。
威尼斯对此禁令和逐出教会的行为毫不在意，命令其神父继续履行职务。
威尼斯在这一决定上得到了修士保罗·萨尔皮（Paolo Sarpi）的支持，他是一位尖锐的争议作家，并于1606年被任命为威尼斯议会的神学和教会法顾问。
禁令在一年后被解除，法国介入并提出了一项妥协方案。威尼斯对重申任何公民都不高于正常法律程序的原则感到满意。
与哈布斯堡西班牙和神圣罗马帝国的竞争导致威尼斯在意大利和北亚德里亚海的最后几场重要战争。
1615年至1618年间，威尼斯在乌斯科克战争（Uskok War）中与奥地利的费迪南德大公（Archduke Ferdinand）交战，在北亚德里亚海和共和国的东部边界作战。
而在西部的伦巴第，威尼斯军队在1617年与西班牙米兰总督佩德罗·德·托莱多·奥索里奥（Don Pedro de Toledo Osorio）的部队在克雷马（Crema）附近发生小规模冲突，1618年又在伦巴第乡村进行交战。
在同一时期，西班牙那不勒斯总督佩德罗·特列斯-吉隆（Don Pedro Téllez-Girón）因商业纠纷与威尼斯在拉古萨（Ragusa）战斗，之前他间接支持费迪南德参与乌斯科克战争。
脆弱的和平未能持久，1629年，威尼斯共和国在曼图亚继承战争（War of the Mantuan Succession）中重新与西班牙和神圣罗马帝国开战。
在这场短暂的战争中，由普罗维迪托尔扎卡里亚·萨格雷多（provveditore Zaccaria Sagredo）指挥的威尼斯军队，在法国盟友的增援下，在维拉布纳战役（battle of Villabuona）中惨遭帝国军队的溃败，威尼斯最亲密的盟友曼图亚遭到洗劫。
然而，神圣罗马帝国和西班牙在其他地方的失败确保了威尼斯没有领土损失，曼图亚公国被恢复给查尔斯二世·贡扎加（Charles II Gonzaga），他是威尼斯和法国支持的候选人。
17世纪下半叶，威尼斯与奥斯曼帝国之间也爆发了长期战争。
在克里特战争（Cretan War，1645-1669）中，经过长达21年的英雄围攻，威尼斯失去了其主要的海外领土——克里特岛（Crete），尽管仍保留了斯皮纳龙加（Spinalonga）和苏达（Suda）的基地，而在达尔马提亚则取得了一些进展。
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